引言
某一寡核苷酸原料药产品在最后一道生产工序需经过滤来脱盐和去除细菌内毒素，对物料进行脱盐和去除细菌内毒素，是一道重要的工序。
考察切向流超滤技术有三个验证指标，通过检测溶液过滤前后细菌内毒素含量，确认超滤系统去除细菌内毒素的功能；进行超滤系统膜包的完整性检测研究，证明其在使用后的完整性，保证膜包过滤后的完好；水通量（NWP）测试，则是为了检验每次系统使用后膜堆的清洗效果。
验证部分
1.材料与仪器准备
自来水、除热原后西林瓶、细菌内毒素检查用水、细菌内毒素标准品、50mL量筒、1000mL量杯。
切向流超滤系统与膜包、内毒素凝胶法检测仪、洁净工作台、旋涡混合器
2.实验方法
2.1 细菌内毒素检测
对于小核酸物料的内毒素水平控制，一方面主要依赖于厂房环境、原料、接触物料容器具等物料的无菌和内毒素水平控制，一方面也可通过超滤的形式，以30KD或50KD截留精度膜包对小核酸物料进行超滤，实现对部分内毒素聚体的有效截留，使目标小核酸产物在透过端得到收集，实现其一定程度上对内毒素水平的有效把控。另外，对于相关缓冲液溶液的内毒素控制通常可以采用6-10KD的超滤膜包实现99.99%以上的截留去除效率。
采用自来水代替药品溶液进行试验，自来水经过超滤前后，分别用经过除热原后西林瓶各取10瓶水进行细菌内毒素检查（每瓶3ml）。
2.2 判断标准
经过超滤系统过滤的自来水细菌内毒素结果应＜0.25EU/ml。
2.3实验结果
表1 过滤前后细菌内毒素检测结果
过滤前后细菌内毒素检测结果显示，供试品在过滤前，细菌内毒素部分结果不符合要求，经过过滤后，检测结果合格，说明该超滤系统对细菌内毒素有去除作用。
2.4膜包完整性测试
检查膜包的完整性是否符合要求，检测方法如下：
典型测试方法之—扩散流：自检--排空管路--计算上游体积--计算扩散流速--结束。
STEP 01 自检：
通过比例调节阀对管路内部施加90psi左右的气压，监控P1,P2,P3三处压力的变化情况，来检测整体管路是否有泄漏的地方。
STEP 02 排空管路：
通过比例调节阀对管路内部施加15psi左右的气压，对整体管路进行排空吹扫，使管路内部无杂质污染，确保管路内部充满洁净的压缩空气。
STEP 03 计算上游体积：
通过比例调节阀，给储气罐(体积v1)充入一定压力的压缩空气(压力p1)，再切换相应的电磁阀，使得储气罐内的气体充满整个上游空问(体积v2)，此时再测量出整体上游空问压力(p2)。根据封闭空间内气体体积置换公式 p1v1=p2v2，计算滤芯/滤膜上游空间的体积v2。
STEP 04 计算扩散流速：
根据理想气体方程式:m=PV/RT,通过电气比例调节阀，给储罐充入一定压力的压缩空气，再将其压缩空气释放到滤芯/滤膜上，根据单位时间内，气体压力的变化，计算出单位时间内，管路内气体损失的体积，即为气体的扩散流速。
扩散流速D=AP*V/Pt100*t
AP:测量时间内气体的压力衰减
V:滤芯/滤膜的上游体积
Pt100:标准大气压
t:测量时间
STEP 05 结束：
打开电磁阀V5，释放管路中的压缩空气。
Bio-TFF Test完整性测试仪是一款自动化的滤膜完整性检测设备，内置压力保持、气泡点、扩散流速和浸入法四种检测方式，检测快速，操作简单，用户可根据滤膜种类自定义检测条件，系统软件可自动进行数据记录，满足审计追踪功能，也支持测试结果打印。
2.5水通量（NWP）检测
水通量测试即在受控条件下测量通过膜包的流量。将测量值转换为标准水通量，标准水通量值指示膜包的性能好坏。通常情况下，测试的NWP不应该低于最初标准的80%。
1.使切向流超滤系统处于全回流模式，回流端和透过端均与进液容器相连。
2.在循环储罐中加入足量的去离子水或注射用水。完全打开进液、回流和透过端阀门。
3.启动进液泵，调节泵速和回流阀以获得0.33bar(5 psi)的跨膜压差。根据透出端的天平称重和测量时间，换算出透出流速。测量并记录进液罐中的水温。
4.调节进液泵和回流端阀门以获得1bar(15 psi)的跨膜压差。根据透出端的天平称重和测量时间，换算出透出流速。测量并记录进液罐中的水温。
5.排干系统。
6.计算水通量，通过以下公式把透过液流速转化为水通量：
7.绘制计算的水通量值与跨膜压差的关系图
8.将计算所得的水通量值乘以不同温度下的粘度(温度)校正系数。例如，0.7 bar(10 psi)的水通量为115LMH，并且在透过液流速测量时水的温度为18℃，则标准化到20°C是：115 LMHx1.053=121LMH
9.将水通量值转化为1psi跨膜压差下的标准值，将水通量值除以10 psi。
例如：121 LMH÷10=12.1 LMH/psi
汉凰科技的超滤系统，已内置水通量测试功能，直接调用，可自动测试膜包的水通量。
通过验证数据表明，超滤系统测出的NWP恢复率均能达到80%以上，说明膜包反复使用过后，NWP衰减幅度不大，证明该系统平时清洗剂的选择和清洗程序符合验证要求，可继续用于日常的生产。
3.浓缩和脱盐步骤
3.1 膜包孔径选择
需根据小核酸分子量选择（如5-30nt的寡核苷酸通常选用1-3 kDa截留膜），有两种膜材聚醚砜（PES）或再生纤维素（RC）膜可选。
3.2 操作步骤
浓缩：将纯化后的小核酸溶液加入超滤装置，通过切向流循环浓缩至目标体积（如原体积的10%），避免过度浓缩导致膜堵塞，一般情况下，操作的TMP控制在1.0-1.5bar范围内。而在超滤过程中因超滤膜孔径精度过小，即使在TMP相对较高的情况下，透过通量水平依然是相对较低的，这也导致超滤所需工艺时间往往很长。故此，超滤工艺过程中最佳浓缩倍数或换液时间点的确定对工艺时长影响尤为关键。
脱盐：用低离子强度缓冲液（如TE或纯水）置换原液，重复3-5次，直至电导率达标。
实验室级自动切向流过滤系统
以siRNA类药物（英克司兰）的AS链浓为例，经过浓缩和脱盐后，样品的浓度没有损失，回收率可达96%以上。
结论
通过对切向流超滤系统和膜包的验证，证明了该系统可用于寡核苷酸样品的浓缩脱盐和内毒素去除功能，且日常采取了正确的清洗程序，能够保证良好的清洗效果，并由此说明该技术验证方案是合乎日常实际生产的，通过验证，降低了日常维护成本，有利于系统的正常运行。
